H9N2亚型禽流感病毒非结构蛋白基因NS1的表达及其单克隆抗体的研制

利用RT-PCR技术扩增获得了H9N2亚型禽流感病毒的NS1基因,ORF长度为654bp。成功构建了重组表达载体pET-NS1,将其转化BL21,并诱导表达出了相对分子质量大约为28 000的NS1融合蛋白。NS1融合蛋白经His trap Hp Kit柱子纯化,采用缓慢稀释和透析相结合的方法复性H9N2-NS1蛋白,获得纯度较高的NS1蛋白,以纯化的NS1免疫BALB/c小鼠,间接接ELISA方法筛选阳性克隆,对获得的抗H9N2-NS1单克隆抗体（McAbs）进行特异性分析;建立了2株稳定分泌抗H9N2-NS1McAbs的杂交瘤细胞系6B9和6C2;腹水的特异性鉴定结果表明,2株McAbs能特异性的识别H9N2-NS1,而与H5N2亚型AIV、H9N2亚型AIV、NDV、IBV、IBDV、ILTV、EDS76均不发生反应。Western blotting鉴定表明,所获得的单抗只与NSl蛋白条带反应。亚类显示,6B9为IgG1,6C2为IgG2b。结果表明,2株抗H9N2-NS1McAbs的制备对H9N2亚型禽流感病毒检测试剂盒的研制以及该病的防治有重要意义。另外,NSl蛋白单抗的成功研制为进一步研究NSl蛋白的结构、功能与细胞的相互作用机制及AI遗传变异规律奠定了一定的基础。     

牛支原体肺炎流行RT-PCR方法的初步诊断

设计5对引物,对山东某一牛交易市场采集的64份鼻腔棉拭子样品进行了病原学检测。对所有样品进行差异脲原体、牛支原体、牛生殖道支原体、牛眼支原体和牛传染性胸膜肺炎(CBPP)PCR病原学检测,PCR产物连接T载体测序。PCR结果显示,牛支原体阳性样品7份,牛生殖道支原体、牛眼支原体和牛丝状支原体全部为阴性;测序结果显示,所测样品核酸序列与牛支原体和无乳支原体核酸序列都具有很高的同源性。对核酸序列进行遗传进化树分析表明,相对于无乳支原体而言,所测核酸序列与牛支原体物种具有更近的遗传距离。     

广东西瓜上检测到甜瓜黄斑病毒

在广东发现了可能被番茄斑萎病毒属(Tospovirus)病毒侵染的西瓜,采用ELISA和RT-PCR法对该西瓜病样进行了检测,西瓜病叶粗汁液不与番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)和西瓜银斑驳病毒(Watermelon silver mottle virus,WSMoV)的血清发生反应;利用引物J13/UHP通过RT-PCR可以扩增出约1400 bp的基因片段,该片段包括一个840 bp的核衣壳蛋白ORF,其推导的氨基酸序列与已报道的Melon yellow spot virus(MYSV)NP基因氨基酸序列的同源率都为99%,进化树分析表明侵染广东西瓜的病毒(命名为MYSV-GZ)属于Tospovirus的MYSV血清组。     

牛轮状病毒TaqMan实时荧光RT-PCR 快速检测方法的建立

本研究按照牛轮状病毒(BRV)结构蛋白VP6基因序列,设计合成引物和探针,经各反应条件的优化,建立了BRV TaqMan实时荧光定量RT-PCR技术。对BRV进行了特异性、敏感性和重复性试验。结果表明,TaqMan实时荧光RT-PCR最低可检测到100个拷贝病毒RNA;与牛病毒性腹泻病毒(BVD)、猪瘟病毒(CSFV)、牛结核杆菌(MB)和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)不发生交叉反应;所制作的标准曲线在10²~10⁹拷贝/μL浓度范围内有极好的线性关系且线性范围宽,相关系数为0.997;与常规的RT-PCR相比,该方法具有快速、特异、敏感、重复性好、可同时检测大量样品等优点。可对样品中微量BRV进行准确检测,对BRV的诊断有重要意义。     

黄瓜花叶病毒的RT-PCR检测

根据黄瓜花叶病毒(CMV)的复制酶基因序列设计、合成引物,以感病组织和健康组织总RNA为模板,CMV质粒作为RT-PCR反应的阳性对照,进行cDNA合成和PCR扩增.对2002-2003年采集的98份黄瓜病毒病样本进行了检测,结果从感病组织中扩增出与预期的767bp大小一致的目标片段,而健康组织无此扩增产物.结果表明98份材料中96.94%检测到CMV.     

梅山猪、大白猪和梅大杂交猪背最长肌中差异表达的14个表达序列标签的分离、鉴定及组织表达分析

为了揭示猪杂种优势的分子机理,利用mRNA差异显示技术研究梅山猪,大白猪和梅大杂交猪背最长肌中基因表达的差异,分离14条在杂种与纯种背最长肌中差异表达的表达序列标签(EST),并用半定量RT-PCR鉴定.核苷酸序列分析表明,这14个EST与已知的基因或表达序列标签没有明显的同源性,随后这14条EST被提交到GenBank数据库.组织表达谱分析揭示了这些EST在心、脾、肝、肾、小肠、卵巢、肺等绝大多数组织中表达,说明这些基因对生命过程很重要.这些研究结果表明梅山×大白杂交组合的杂种与纯种之间的不同基因差异表达的方向存在巨大差异,猪杂种优势可能是在一定阶段有诸多不同的必不可少的基因向各种方向差异表达共同作用的结果.     

CHANGES IN GROWTH AND GENE EXPRESSION INDUCED BY SULFUR DEFICIENCY IN GARLIC

ABSTRACT

Sulfur deficiency in garlic Allium sativum L. caused a reduction in growth together with chlorosis and necrosis of leaves. Large differences in shoot sulfur and sulphate concentrations between deficient and high sulfur treatments were only observed after 54 days growth. Using the mRNA differential display technique, a novel cDNA was isolated from shoots grown in sulfur depleted nutrient solution for 24 days. This novel cDNA was constitutively expressed in the shoots during further growth in sulfur depleted solution, but it was undetectable following 30 days recovery with sulfur supplementation. The cDNA sequence demonstrated a high degree of identity with a coat protein gene of a garlic latent carlavirus. The results suggest a possible relationship between low plant sulfur status and the induction of a latent carlavirus in garlic.     

神经肽S及其受体在猪免疫器官中的表达及分布

本研究采用半定量RT-PCR方法,对神经肽S(NPS)及其受体(NPSR)mRNA在猪免疫器官中的表达水平进行检测。结果表明,NPSmRNA在胸腺、脾、空肠淋巴结和软腭扁桃体中均有表达,且在脾和胸腺中的表达水平较高;NPSR mRNA在脾脏的表达水平最高。进一步利用免疫组织化学法对NPS在猪免疫器官中的分布定位进行了研究,在猪脾脏和空肠淋巴结均有NPS免疫阳性细胞分布,但在软腭扁桃体和胸腺中未见NPS免疫阳性细胞。再进行免疫接种猪传染性胃肠炎疫苗,运用半定量RT-PCR技术检测免疫接种后不同时间(3、7、14 d)NPS及其受体mRNA在猪免疫器官中表达水平的变化规律。结果表明,NPS mRNA和NPSR mRNA在胸腺、脾、淋巴结和扁桃体中均有表达,且在一定时间范围内呈现先升高后下降的变化规律,但对照组无明显的升高和下降现象。上述结果提示,猪NPS可能参与免疫功能的调节。     

鸡传染性支气管炎病毒的分离与鉴定

鸡传染性支气管炎对全球养鸡业带来巨大损失，虽已有商品化疫苗用于临床预防该疾病，免疫鸡群高发病率、高死亡率现象仍然常见。本试验旨在为重庆地区的传支流行毒株进行调查。通过病毒的分离培养和高变区部分序列测序，发现流行于重庆地区的鸡传染性支气管炎毒株与现有的疫苗毒株存在较大差异。某些位点的基因突变与病毒特性的改变之间是否存在联系还需要进一步的研究。